在本節中，您將使用所謂的均方根偏差（RMSD）分析系統平衡的程度。 RMSD描述了選擇的一個給定的分子偏離空間中一個確定位置的量。您將使用來自水球中泛素最小化和平衡的輸出文件來計算RMSD值並分析模擬的平衡程度。將計算整個蛋白質的所有蛋白質主鏈原子（不含氫）和不含最後五個殘基的蛋白質的RMSD值。
1.8.1整個蛋白質的RMSD
您的最小化--平衡模擬生成了一個稱為ubq-ws-eq.dcd的軌跡文件。這個軌跡文件是在平衡過程中計算蛋白質RMSD的關鍵。模擬是在一個所謂的N V T係綜中進行的，其中粒子數N、體積V和溫度T保持不變。
VMD包括許多分析工具。其中之一，NAMDPlot插件，可以用於打NAMD輸出的log文件。這個VMD插件使用程序namdplot,它從log文件中獲取能量、溫度等隨時間變化的相關數據。然後VMD使用一個內部繪圖程序為您繪製數據。相關教程的網址：www.ks.uiuc.edu/Research/namd/utilities/.
1、 打開VMD。
2、 在VMD主窗口中點擊Extensions-Analysis-NAMDPlot啟動NAMD繪圖插件。
3、在NAMDPlot窗口中，選擇File --Select NAMD Log File，選擇文件ubq_ws_eq.Log並單擊打開。確保您位於1-2-sphere目錄中。
4、 NAMD的log文件中的所有熱力學變量都可用在VMD的NAMDPlot中繪製。 TS代表時間步，BOND代表鍵能，以此類推。單擊標記為TEMP的框，然後選擇File--Plot Selected Data。這將繪製所有log日誌文件中的溫度數據並隨時間的變化。如圖：
5、嘗試使用NAMDPlot來計算TOTAL(總能量)。您應該看到變量收斂到平衡系統的平均值。
你在上面檢查的熱力學變量告訴你整個系統的熱力學狀態。但你也想知道你的蛋白質是否構象穩定。為此，您將計算蛋白質骨架的RMSD。這會讓你了解蛋白質的穩定性。如果在運行結束時RMSD仍然在增加，這意味著你的蛋白質仍然在尋找一個較低的能量狀態，因此還沒有達到平衡。
6、 檢查完繪圖後，關閉Multiplot窗口。
均方根偏差。均方根偏差（RMSD）是对两种结构之间差异的数值测量。定义如下：
注意，蛋白質的RMSD會隨著時間的推移而改變。另外，請注意，您使用的腳本將模擬的第一步作為參考，而不是使用平均值。
您將使用VMD計算RMSD值：
7、加載水球psf文件ubq_ws.psf，它在你的common目錄中。在VMD主窗口中點擊File--New Molecule，在common目錄中找到ubq_ws.psf，然後雙擊它。然後單擊“Load”。
8、單擊Molecule File Brower窗口中的Browse按鈕。單擊目錄1-2-sphere，雙擊選擇ubq_ws_eq.dcd。然後單擊“Load”。你已經加載了平衡的軌跡文件。
9、我們要使用的腳本名為rmsd.tcl。這是腳本內容：
set outfile [open rmsd.dat w]
set nf [molinfo top get numframes]
set frame0 [atomselect top "protein and backbone and noh" frame 0]
set sel [atomselect top "protein and backbone and noh"]
# rmsd calculation loop
for { set i 1 } { $i <= $nf } { incr i } { #與C語言一樣，
$sel frame $i #將sel變量設置為第i幀
$sel move [measure fit $sel $frame0]
puts $outfile "[measure rmsd $sel $frame0]" #計算第i幀和第1幀的RMSD
}
close $outfile
10、這些腳本的意思是
• 打開 rmsd.dat ，只寫入.
set outfile [open rmsd.dat w]
• 獲得軌跡文件的幀數並製定這個數是變量nf
set nf [molinfo top get numframes]
• 選擇分子的第一幀frame 0作為其他幀的比較對象。選擇包含蛋白質骨架中的原子，不包括氫原子：
set frame0 [atomselect top "protein and backbone and noh" frame 0]
• 一個未確定的幀的變量sel也做同樣的選擇
set sel [atomselect top "protein and backbone and noh"]
• 在 #之後是解釋的註釋語句.
# rmsd calculation loop
• 軌跡中的所有循環:
for { set i 1 } { $i <= $nf } { incr i } {
• 改變選擇的幀變量 $sel 到比較的幀.
$sel frame $i
•計算適合兩種選擇的矩陣。將此矩陣應用於第二個選擇以校核分子:
$sel move [measure fit $sel $frame0]
•計算兩個選擇幀之間的 RMSD, 並把它寫到文件裡:
puts $outfile "[measure rmsd $sel $frame0]"
您可以使用系統的腳本來測試平衡。
11、在VMD主窗口中的Tk控制台鍵入source rmsd.tcl。這將執行腳本中的所有命令。腳本將輸出一個文件rmsd.dat，包含蛋白質主鏈原子隨著時間變化的rmsd值。
Dcd一共0-9幀，0幀為參考，出來9個rmsd值，如下。
在VMD之外，可以使用繪圖程序查看此數據。例如gnuplot、xmgrace、Microsoft Excel、Mathematica和scilab。我們將使用MicrosoftExcel繪製rmsd.dat.
12、打開Excel。
13、單擊“文件”—“打開“—”瀏覽“，導航到目錄1-2-sphere，確保下拉菜單“所有Excel文件”設置為“所有文件”， 然後選擇文件rmsd.dat，否則出不來rmsd.dat。
14、如果出現文本導入嚮導，請為文件類型選擇分隔符，然後單擊完成。 RMSD值將出現在A列的第1-9行中。
15、我們明確將以ps為單位指定時間，以便Excel繪製0-8 ps的值，而不是1-9 ps的值。在B1-B9單元格中，寫入0-8的值，每個單元格一個值。
16、單擊“插入”—“圖表”，選擇XY（散點圖）作為圖表類型，選擇右下角的圖表子類型，然後單擊它。
17、單擊“序列”選項卡，然後單擊“X值”字段旁邊的紅色按鈕。選擇單元格B1-B9並單擊紅色按鈕返回窗體。對Y值字段執行同樣的操作，選擇單元格A1-A9。單擊“下一步”。
18、 步驟3，
並輸入以下文本：圖表標題：Ubiquitin RMSD
值（X）軸：時間（PS）
值（Y）軸：RMSD（a）點擊下一步，然後完成。
19、雙擊y軸，以便出現“格式軸”窗口。單擊“坐標軸選項”，將最小值設置為適當的值以使您能夠清楚地看到數據，然後單擊“完成”。對圖表進行你所想的任何其他樣式更改。
由於dcd文件運行時間短且低頻率讀入數據，曲線不會顯示太多信息。圖8顯示了平衡系統的一個更典型的RMSD圖以及生成的圖。你能看到第一條RMSD曲線變平嗎？這意味著系統是平衡的。 （隨著NMAD不斷更新，你算的結果可能和教程上的不完全一致，這個現像是正常的）
1.8.2 RMSD
蛋白質的最後5個殘基，相對於蛋白質其他殘基相比不穩定。你認為在這種情況下RMSD與整個蛋白質有什麼不同？
1、您可以很容易地修改rmsd.tcl，以便在沒有最後五個殘基的情況下繪製蛋白質的rmsd。複製一個 rmsd.tcl，重新更名為rmsd_nolaxt5.tcl。
2、單擊“開始”，使用寫字板打開新文件rmsd_5.tcl。請注意，嘗試打開文件時，應將“文件類型”下拉菜單設置為“所有文件”。 （ps：我的雙擊，默認寫字板打開即可）
3、編輯內容：
Line 1: open rmsd.dat w 變成：open rmsd-nolast5.dat w
Line 3: ...and noh" 變成：...and noh and not (resid 72 to 76)"
Line 4: ...and noh" 變成：...and noh and not (resid 72 to 76)"
4、通過單擊“文件”保存”文件”並退出。
5、在VMD的TkCon窗口中輸入source rmsd-nolast5.tcl。這將執行腳本中的所有命令。腳本將編寫一個rmsd-nolast5.dat文件，該文件將包含蛋白質主鏈的rmsd值與時間的關係，而不包含最後五個殘基。
6、使用Excel以與以前rmsd.dat相同的方式繪製文件rmsd-nolast4.dat文件。
7、分析完繪圖後，關閉Excel。
8、使用VMD主窗口，刪除ubq_ws.psf分子。
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